一、生物系統(tǒng)中的去污劑
去污劑是兩性分子，其長親脂性烴基(尾部)末端連有極性或帶電荷的親水基團(tuán)(頭部)(圖1)。它們能夠降低水的表面張力，因此也被稱為表面活性劑。
圖1 陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的結(jié)構(gòu)，其中顯示了親水和疏水區(qū)域
與純極性或非極性分子不同，兩性分子在水性介質(zhì)中表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)。它們的極性基團(tuán)與水分子形成氫鍵，而烴鏈由于疏水相互作用而聚集。在低濃度下，去污劑在水中以單體形式存在，當(dāng)濃度足夠高時(shí)，即達(dá)到臨界膠束濃度(CMC)時(shí)，單體自發(fā)形成非共價(jià)聚集物，成為膠束。
在膠束中，每個(gè)去污劑分子的極性親水區(qū)域朝向極性溶劑(水)，而疏水區(qū)域形成熱力學(xué)穩(wěn)定的疏水核。圖2為膠束簡圖，其解釋了膠束的方向概念。真實(shí)的膠束結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、更動(dòng)態(tài)，并且可能隨去污劑濃度和溶液組成而變化。
圖2 SDS膠束簡圖
二、去污劑如何溶解膜蛋白？
去污劑被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究。常見的應(yīng)用包括細(xì)胞裂解、膜蛋白和脂質(zhì)溶解、蛋白質(zhì)結(jié)晶以及減少印跡實(shí)驗(yàn)的背景染色。
盡管研究膜蛋白是蛋白質(zhì)生物化學(xué)中的一大難題，但由于膜蛋白具有顯著的生物學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)性，它們依然是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。了解膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能需要小心分離出高純度的天然膜蛋白。由于形成膠束的去污劑提供的兩性環(huán)境可模仿脂質(zhì)雙分子層，因此，它們成為膜蛋白功能和結(jié)構(gòu)研究中必不可少的增溶劑。
生物膜由磷脂構(gòu)成，磷脂含有兩個(gè)疏水基團(tuán)以及與之相連的一個(gè)極性頭部。這種分子結(jié)構(gòu)使磷脂能夠組裝成脂質(zhì)雙分子層，其中疏水鏈面向彼此，而極性頭部朝向外側(cè)的水溶液環(huán)境(圖3)。蛋白質(zhì)和脂質(zhì)鑲嵌在這個(gè)雙層結(jié)構(gòu)中，形成流動(dòng)鑲嵌模型(圖4)，該模型于1972年由Singer和Nicolson首次提出。脂質(zhì)尾部與疏水蛋白質(zhì)區(qū)域之間的疏水相互作用使蛋白質(zhì)保留在脂質(zhì)雙分子層中。這些內(nèi)在膜蛋白(IMP)(圖4)不溶于水溶液，因?yàn)樗鼈兙奂谝黄鹂杀Ｗo(hù)其疏水區(qū)域；但它們可溶于去污劑，因?yàn)槿ノ蹌┬纬傻哪z束與生物膜雙分子層具有相似的結(jié)構(gòu)。
疏水相互作用將蛋白質(zhì)整合至這些膠束中。通常鑲嵌在膜脂質(zhì)雙分子層中的膜蛋白疏水區(qū)域，現(xiàn)在被一層去污劑分子包圍，而親水區(qū)域暴露于水性介質(zhì)中，從而使膜蛋白溶于溶液。完全去除去污劑會(huì)使膜蛋白疏水區(qū)域聚集，進(jìn)而導(dǎo)致膜蛋白聚集和沉淀。
圖3 磷脂雙分子層
圖4 生物膜的流動(dòng)鑲嵌模型
去污劑的膜溶解過程可以分為三個(gè)階段，其中去污劑-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)比率是一個(gè)重要因素(圖5)。
圖5.去污劑溶解生物膜的三個(gè)階段。當(dāng)向生物膜中加入低濃度去污劑時(shí)(a)，去污劑單體(紅色線條，帶單尾)分散至脂質(zhì)雙分子層中而擾亂膜結(jié)構(gòu)(b)。當(dāng)濃度等于或高于去污劑的CMC時(shí)，脂質(zhì)雙分子層中的去污劑分子飽和并分裂，產(chǎn)生脂質(zhì)-蛋白質(zhì)-去污劑混合膠束(c)。去污劑/蛋白質(zhì)比率約為1-2(w/w)被認(rèn)為足以溶解IMP，以形成脂質(zhì)-蛋白質(zhì)-去污劑混合膠束。去污劑濃度進(jìn)一步增加會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)-蛋白質(zhì)-去污劑混合膠束逐漸脫脂，形成脂質(zhì)/去污劑和蛋白質(zhì)/去污劑混合膠束(d)。復(fù)合物中溶解的IMP與去污劑結(jié)合，產(chǎn)生蛋白質(zhì)-去污劑復(fù)合物(PDC)。通常，去污劑/蛋白質(zhì)比率約為10 (w/w)或更高時(shí)，將導(dǎo)致完全脫脂。
三、去污劑的分類
1、離子去污劑
離子去污劑含有陰離子或陽離子頭部基團(tuán)并具有凈電荷。它們的疏水尾部是直烴鏈(如十二烷基硫酸鈉(SDS)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB))或剛性甾體基團(tuán)(如膽汁酸鹽)。離子去污劑膠束的尺寸取決于側(cè)鏈的疏水引力與離子基團(tuán)的排斥力的綜合作用。因此，通過增加反荷離子的濃度來中和頭部基團(tuán)的電荷，將導(dǎo)致膠束尺寸變大。膠束尺寸也會(huì)隨烷基鏈長度的增加而增加。離子去污劑對(duì)于膜蛋白的溶解非常有效，但幾乎都會(huì)導(dǎo)致一定程度的變性。
十二烷基硫酸鈉（SDS）
| 產(chǎn)品編號(hào) | CAS編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
| 3241178 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | dust-free pellets, ≥99.0% (GC) |
| 3241179 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | BioReagent, suitable for electrophoresis, for molecular biology, ≥98.5% (GC) |
| 3241180 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | BioXtra, ≥99.0% (GC) |
| 3241181 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | for ion pair chromatography, ≥99.0% |
| 3241182 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | ACS reagent, ≥99.0% |
| 3241183 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | ReagentPlus, ≥98.5% (GC) |
| 3241184 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | 92.5-100.5% based on total alkyl sulfate content basis |
| 3241185 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | BioUltra, for molecular biology, ≥99.0% (GC) |
| 3241186 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | ≥98.0% (GC) |
| 3241187 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | tested according to NF, mixture of sodium alkyl sulfates consisting mainly of sodium dodecyl sulfate |
| 3241188 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | ≥90% |
| 3241189 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | ≥99.0% (GC), dust-free pellets |
| 3241190 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | Vetec TM reagent grade, ≥98% |
| 3241191 | 151-21-3 | 十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate) | anhydrous, free-flowing, Redi-Dri TM, ACS reagent, ≥99.0% |
十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）
| 產(chǎn)品編號(hào) | CAS編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
| 3096279 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | PharmaGrade, USP/NF, Manufactured under appropriate controls for pharma or biopharmaceutical production. |
| 3096280 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | BioXtra, ≥99% |
| 3096281 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | Vetec TM reagent grade, 96% |
| 3096282 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | BioUltra, for molecular biology, ≥99.0% (AT) |
| 3096283 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | for molecular biology, ≥99% |
| 3096284 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | for ion pair chromatography |
| 3096285 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | ≥98% |
| 3096286 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | analytical standard |
| 3096287 | 57-09-0 | 十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium Bromide) | ≥96.0% (AT) |
膽汁酸鹽是一種陰離子去污劑，其主鏈由剛性甾體基團(tuán)組成，如膽酸鈉鹽和脫氧膽酸鈉鹽。
| 產(chǎn)品編號(hào) | CAS編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
| 3241719 | 345909-26-4 | 牛膽酸鈉 水合物 | ≥97.0% (TLC) |
| 3248791 | 345909-26-4 | �；悄懰� 鈉鹽 水合物 | ≥95% (TLC) |
| 3248792 | 345909-26-4 | �；悄懰� 鈉鹽 水合物 | BioXtra, ≥95% (TLC) |
這些分子的平面結(jié)構(gòu)使其具有一個(gè)極性面和一個(gè)非極性面；因此，它們的CMC較高，膠束較小，使其易于通過透析去除。膽汁酸是相對(duì)溫和的去污劑，其滅活作用通常低于具有相同頭部基團(tuán)的直鏈去污劑。游離膽汁酸單體的pKa值約為5-6，并且在低pH值下具有有限的溶解度。然而，膽汁酸的綴合會(huì)降低pKa，并且會(huì)在任何給定pH下產(chǎn)生更大比例的離子化分子。由于膽汁酸的離子化鹽形式比質(zhì)子化酸形式更易溶于水，因此其綴合增強(qiáng)了在低pH環(huán)境中的溶解度。
2、非離子去污劑
非離子去污劑含有不帶電的親水頭部基團(tuán)，其由聚氧乙烯部分(如BRIJR和TRITON™去污劑)或糖苷基團(tuán)(如辛基葡糖苷和十二烷基麥芽糖苷)組成。由于非離子去污劑會(huì)破壞脂質(zhì)-脂質(zhì)和脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，但不會(huì)破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，所以其被認(rèn)為是非變性去污劑。正因如此，它們被廣泛用于分離生物活性形式的膜蛋白。與離子去污劑不同，鹽對(duì)非離子去污劑的膠束尺寸影響很小。
具有聚氧乙烯頭部基團(tuán)的去污劑可能含有化學(xué)通式為CnH2n+1(OCH2CH2)xOH的烷基聚乙烯，或位于烷基鏈和醚基之間的苯環(huán)。TRITON™X-100去污劑屬于后者。應(yīng)注意，含芳環(huán)的去污劑在紫外區(qū)域具有光吸收，這可能會(huì)干擾在280nm處的蛋白質(zhì)分光光度監(jiān)測(cè)。這些去污劑還有氫化形式可供選擇，其通過還原芳環(huán)而消除紫外吸收。
| 產(chǎn)品編號(hào) | CAS編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
| 3256173 | 9002-93-1 | Triton™ X-100 | BioUltra, for molecular biology, ~10% in H2O |
| 3256166 | 9002-93-1 | Triton™ X-100 | for molecular biology |
| 3256167 | 9002-93-1 | Triton™ X-100 | Vetec TM reagent grade |
| 3256168 | 9002-93-1 | Triton™ X-100 | laboratory grade |
但是，這種還原制劑中可能存在少量未反應(yīng)的物質(zhì)。或者，含有脂質(zhì)疏水基團(tuán)的市售聚氧乙烯去污劑可以取代某些應(yīng)用中的芳香族聚氧乙烯。例如，在紫外不可見性比較重要的應(yīng)用中，TERGITOL™ 15-S-9、TERGITOL™ TMN-10、聚氧乙烯月桂醇醚和聚乙二醇10十三烷基醚通�？商娲鶷RITON™ X-100。這些去污劑具有脂質(zhì)疏水基團(tuán)，因此在紫外區(qū)域無明顯光吸收。
盡管聚氧乙烯比合成非離子去污劑(如烷基糖苷)具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)，但后者仍是許多應(yīng)用的首選去污劑，主要有兩個(gè)原因。第一，合成非離子去污劑的成分和結(jié)構(gòu)均勻。第二，含有不同烴鏈和極性糖基團(tuán)組合的幾種烷基糖苷變體易于合成為純凈物形式。烷基糖苷具有連接至葡萄糖、麥芽糖或蔗糖頭部基團(tuán)的各種烷基鏈，使其在物理化學(xué)性質(zhì)方面具有微小差異，這種差異可用于膜蛋白的選擇性增溶。
3、兩性離子去污劑
兩性離子去污劑兼具離子和非離子去污劑的特點(diǎn)。與非離子去污劑一樣，兩性離子去污劑不具有凈電荷，缺乏導(dǎo)電性和電泳遷移率，并且不與離子交換樹脂結(jié)合。但是，與離子去污劑一樣，它們能夠有效破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。甾體類兩性離子去污劑，如CHAPS，比直鏈兩性離子去污劑(如，十二烷基二甲基二胺氧化物)的變性能力弱。
四、去污劑選擇指南
如果以100,000×g的速度將裂解物或勻漿物離心1小時(shí)后，膜蛋白存在于上清液中，則認(rèn)為膜蛋白已溶解。在大多數(shù)情況下，經(jīng)過去污劑溶解后，膜蛋白的生物活性應(yīng)保留在上清液中。因此，合適的去污劑應(yīng)將最大數(shù)量的生物活性蛋白質(zhì)保留在上清液中。目前市面上有大量的去污劑，因此，選擇合適的去污劑可能非常困難。以下幾點(diǎn)建議將有助于選擇合適的去污劑：
1、查閱文獻(xiàn)并嘗試一種曾被用于分離和表征具有相似生化或酶學(xué)特性的蛋白質(zhì)的去污劑；
2、考慮去污劑在工作溫度下的溶解度。例如，二甲基棕櫚基氨丙磺酸鹽(SB3-16)在4℃不溶于水，而TRITON™ X-114去污劑在室溫下會(huì)發(fā)生相分離；
3、考慮去污劑的去除方法。如果使用透析法，則最好使用具有高CMC的去污劑。另外，如果使用離子交換色譜法，則非離子或兩性離子去污劑更合適；
4、為保留生物或酶活性，可能需要對(duì)多種去污劑進(jìn)行試驗(yàn)。去污劑的類型和用量都會(huì)影響蛋白質(zhì)活性。有些蛋白質(zhì)的生物活性僅能在非常窄的去污劑濃度范圍內(nèi)保留。低于該濃度范圍，蛋白質(zhì)不溶解；而高于特定濃度，蛋白質(zhì)將失活；
5、考慮下游應(yīng)用。由于TRITON™ X-100去污劑含有的芳香環(huán)可在260-280 nm吸光，因此，如果實(shí)驗(yàn)方案要求對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行紫外監(jiān)測(cè)，則應(yīng)避免使用該去污劑。同樣，如果通過等電聚焦分離蛋白質(zhì)，則應(yīng)避免使用離子去污劑。在蛋白質(zhì)凝膠電泳中，應(yīng)考慮使用聚集數(shù)較小的去污劑；
6、考慮去污劑的純度。應(yīng)使用純度極高的去污劑，因?yàn)門RITON™ X-100等去污劑通常含有過氧化物污染物；
7、對(duì)于應(yīng)避免DNA酶、RNA酶和蛋白酶等污染物的研究，有多種分子生物學(xué)級(jí)別的去污劑可供選擇；
8、無毒去污劑優(yōu)于有毒去污劑。例如，洋地黃苷是一種強(qiáng)心苷，應(yīng)謹(jǐn)慎處理；
9、由于一些未知的原因，特定去污劑通常更適用于一些特定分離程序。例如，正十二烷基-β-D-麥芽糖苷已被發(fā)現(xiàn)是分離細(xì)胞色素C氧化酶的首選去污劑。因此，為確定分離生物活性膜蛋白的最佳條件，可能需要一些試錯(cuò)試驗(yàn)；
10、有時(shí)很難找到一種既適合溶解也適合分析指定蛋白質(zhì)的最佳去污劑。在這種情況下，通�？梢韵扔靡环N去污劑溶解蛋白質(zhì)，然后改用另一種對(duì)分析干擾最小的去污劑來分析蛋白質(zhì)；
11、在某些情況下，已觀察到在分離緩沖液中添加含非去污磺基酸甜菜堿(NDSB)的去污劑，可顯著改善膜蛋白的溶解。
